当前位置:文库下载 > 所有分类 > 自然科学 > 生物学 > 壳聚糖酶的分离纯化及性质研究_韩宝芹
免费下载此文档侵权投诉

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究_韩宝芹

 

第36卷 第2期 2006年3月 

中国海洋大学学报

PERIODICALOFOCEANUNIVERSITYOFCHINA

36(2):255~260Mar.,2006

壳聚糖酶的分离纯化及性质研究

韩宝芹,杨菊林,刘万顺,郝日光

(中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)

摘 要: 以本实验室分离的产壳聚糖酶YJ02菌株出发,制备壳聚糖酶发酵液,经离心、(NH4)-Sepharose2SO4分级盐析、QFastFlow阴离子交换、SephacryS-100凝胶过滤分离纯化步骤,SDS-PAGE显示为一条带,壳聚糖酶纯化了28.9倍,收率为47.6%。该酶的性质研究表明,该酶的分子量为66.2KD,最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0;Mn2+对酶活力有明显的促进作用,Cu2+,Fe3+,Hg2+对酶活力有抑制作用;小分子有机物EDTA和SDS对酶活力有抑制作用,而IAA和β-巯基乙醇对酶活力稍有促进作用。该壳聚糖酶对高脱乙酰度壳聚糖底物水解作用强,酶解位点可能为NGlc-NGlc,酶最大反应速度Vmax=4.1μmol/min,常数Km为64mmol/L。此壳聚糖酶水解壳聚糖制备的壳寡糖数均分子量为2400Da。关键词: 壳聚糖酶;分离纯化;酶学性质;壳寡糖

中图法分类号: Q503     文献标识码: A     文章编号: 1672-5174(2006)02-255-06

  壳聚糖是由2-氨基-D-葡萄糖(GlcN)和2-乙酰氨基-D-葡萄糖(GlcNAc)通过β-1,4糖苷键连接而成的

天然高分子多糖。由于其相对分子量大,分子内强大的氢键引力,壳聚糖不溶于水,在人体内不易被吸收,从而使其应用受到限制。壳聚糖酶(Chitosanase,EC3.2.1.132)是一类能水解壳聚糖的水解酶,广泛存在于一些真菌、放线菌、细菌中,在植物、病毒中也发现有此酶的存在。壳聚糖经酶水解可形成壳寡糖,具有抑制细菌和真菌生长,调节机体免疫和抗肿瘤等功能[5-7]。由酶法水解壳聚糖制备壳寡糖反应条件温和,生产工艺无污染,产品质量好,受到食品、化学工业、生物医学等领域的青睐。对于壳聚糖酶国内外已有较多的研究报道,包括酶的纯化、理化性质、作用机理、结构功能等。但由于大多数微生物产壳聚糖酶的活性低,生产成本相对较高,一直影响壳寡糖的酶法生产。本实验室利用已有的高活性壳聚糖酶菌株发酵制备壳聚糖酶,开展此壳聚糖酶的纯化及基本性质研究,为该酶应用于壳寡糖的工业化生产提供依据。

[1-4]

液调pH至6.0。1.3壳聚糖酶发酵液的制备

3.5L发酵培养基装入5L的发酵罐中,加入0.1mL的消泡剂,115℃灭菌30min,待其冷却后按5%(w/v)的接种量(菌体密达为(1.0~1.4)×107个/mL)将处于对数生长期的菌种175mL接种入发酵罐中,进行发酵培养。根据发酵培养条件实验结果,发酵培养条件为:温度30℃,转速100r/min,pH=6.0,通气量8L/min,定时取发酵液检测壳聚糖酶活力,3d后取下发酵罐,检测酶活力,72h后终止发酵,检测酶活力。1.4壳聚糖酶的分离纯化1.4.1壳聚糖酶的分离纯化  将壳聚糖酶发酵液于4℃,5000r/min离心30min除菌体,搅拌下向上清液中加入固体硫酸铵分级盐析,取20%~70%盐析沉淀物经pH=7.5,0.05mol/LTris-HCl缓冲液透析。透析酶液经PEG20000浓缩,浓缩液上经pH=7.5,0.05mol/LTris-HCl缓冲液平衡的Q-SepharoseFastFlow阴离子交换柱(Υ2cm×10cm),以0~0.5mol/LNaClpH=7.5,0.05mol/LTris-HCl溶液梯度洗脱,流速0.5mL/min,检测波长为280nm,洗脱液分部收集。酶活力部分经PEG20000浓缩,用pH=7.5,0.05mol/LTris-HCl平衡的SephacryS-100凝胶柱(Υ1.6cm×80cm)进一步纯化,洗脱流速0.1mL/min,收集酶活力组分,冷冻干燥,得纯化壳聚糖酶制品。

1.4.2SDS-PAGE分析  采用不连续垂直平板电泳系统,对不同纯化步骤的壳聚糖酶进行SDS-PAGE纯度分析。分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%,电泳采用pH=8.3的Tris-HCl缓冲体系[8]。电泳后考马

1 材料和方法

1.1菌株

本实验室保存的YJ02菌株,该菌株可诱导产生高活性的壳聚糖酶。

1.2发酵培养基

NH4NO31.0%,酵母粉0.4%,K2HPO40.07%,KH2PO40.03%,NaCl0.5%,MgSO4·7H2O0.05%,葡萄糖0.1%,粉末壳聚糖1%,用1mol/LNaOH/HCl溶

基金项目:国家“十五”科技攻关项目(2001BA708B04-07)资助

收稿日期:2005-07-04;修订日期:2005-09-02

(-),女,,教授-:http://www.hjavira.net

第1页

免费下载Word文档免费下载:壳聚糖酶的分离纯化及性质研究_韩宝芹

(下载1-6页,共6页)

猜你喜欢

返回顶部